每一個Western blot都涉及到抗原和抗體的相互作用，因此，抗體濃度并不是一成不變的，優(yōu)化很重要。一抗和二抗?jié)舛热Q于每個抗體的特異性和抗原的特異性，以及樣品中存在的抗原量。每個廠家提供的二抗特異性也不同。在改變實驗參數(shù)，如更換了抗原、一抗、二抗或底物時，有必要重新優(yōu)化。
也許你要問，什么情況下需要優(yōu)化抗原/抗體濃度呢？若Western blot出現(xiàn)了以下的結(jié)果，則你有必要找找原因，優(yōu)化一下抗原/抗體的濃度。
? 信號弱
? 信號迅速地減弱
? 無信號，無背景
? 高背景，白色條帶
? 膜上出現(xiàn)橙色或棕色的點
? 非特異性條帶
? 彌散條帶
? 斑點狀背景
抗體濃度若是利用不同濃度的抗原或抗體，開展多次Western blot，也未嘗不可，但這也太耗時了。折騰兩下，一個星期就過去了。為此，賽默飛世爾旗下Pierce的專家介紹了一個簡便快速的斑點印跡（dot blot）方法。
簡便快速的斑點印跡步驟
你要準(zhǔn)備的材料
? 硝酸纖維素膜，剪成1 cm×8 cm的長條
? 包含抗原的樣品，以PBS、TBS或類似緩沖液稀釋
? 一抗和HRP結(jié)合的二抗
? 封閉液
? 洗滌液
? 底物工作液：HRP的化學(xué)發(fā)光底物（如SuperSignal底物）
? 膠片或CCD成像系統(tǒng)
抗體濃度操作步驟
1. 用TBS或PBS制備蛋白樣品的稀釋液。稀釋度要取決于樣品中存在的抗原濃度。由于抗原濃度通常未知，因此有必要檢測寬范圍的稀釋度。SuperSignal底物有著皮克至飛克水平的檢測靈敏度。因此樣品稀釋可以在微克至飛克范圍。
2. 制備硝酸纖維素膜，用鉛筆標(biāo)上每個待測一抗/二抗的濃度。所需轉(zhuǎn)印膜的數(shù)量取決于待篩查的一抗和/或二抗有多少種不同的稀釋濃度。通常來說，一抗要檢測一到兩個稀釋度，而二抗要檢測兩到三個稀釋度。例如：使用SuperSignal底物，一抗和二抗可如下稀釋：生物通 
    1/1000的一抗和1/50000的二抗
    1/1000的一抗和1/100000的二抗生物通 
    1/5000的一抗和1/50000的二抗
    1/5000的一抗和1/100000的二抗生物通 
3. 將硝酸纖維素膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點在膜上。每個點的體積越少越好（1-5μl），以保證點盡可能地小。如果需要使用5μl以上的樣品，在點完一次后，干燥2-5分鐘，再點一次。讓膜干燥10-15分鐘，或直至無可見水分。
4. 用封閉液封閉膜上的非特異性位點，室溫震蕩孵育1 h。
5. 用包含1/10體積封閉液的洗滌液稀釋一抗，并加到膜上，室溫震蕩孵育1h。
6. 用洗滌液洗膜4次，每次5分鐘，用盡可能大體積的洗脫液。
7. 用包含1/10體積封閉液的洗滌液稀釋二抗，并加到膜上，室溫震蕩孵育1h。
8. 用洗滌液洗膜4次，每次5分鐘，用盡可能大體積的洗脫液。
9. 準(zhǔn)備底物工作液，將等體積的SuperSignal Substrate Luminol/Enhancer溶液與過氧化物溶液混合。制備足夠體積的工作液，以確保印跡點完全濕潤，且印跡點在孵育過程中不會干。建議體積：0.125 ml/cm2印跡。
10. 抗體濃度將膜放在底物工作液中孵育5分鐘。
11. 將膜取出，放在塑料布或其它防護膜上。
12. 蛋白一側(cè)朝上，將印跡貼到膠片上，曝光30-60秒。為獲得*佳結(jié)果，曝光時間可能不同。如果**次曝光不夠，再試試2-5分鐘。另外，也可用CCD相機或其它成像儀。

13. 在一張優(yōu)化好的印跡膜上，底物產(chǎn)生的信號可能會持續(xù)6-24小時，這取決于具體的產(chǎn)品。若結(jié)果不佳，可重新曝光。隨印跡時間的延長，可能需延長曝光時間。如果仍未獲得*佳結(jié)果，可用不同濃度的抗原和/或抗體重復(fù)以上步驟。

豬窖蛋白(CAV1)ELISA試劑盒 porcine Caveolin 1 (CAV1) ELISA Kit 0.156-10 ng/mL 0.05 ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬角蛋白18(KRT18)ELISA試劑盒 porcine Keratin 18 (KRT18) ELISA Kit 0.156-10ng/mL 0.054ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬堿性成纖維細胞生長因子(FGF2)ELISA試劑盒 porcine Fibroblast Growth Factor 2, Basic (FGF2) ELISA Kit 7.813-500pg/mL 3.2pg/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬間隙連接蛋白43(CX43)ELISA試劑盒 porcine Connexin 43 (CX43) ELISA Kit 0.625-40 ng/mL 0.16 ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬甲狀旁腺**(PTH)ELISA試劑盒 porcine Parathyroid Hormone (PTH) ELISA Kit 12.35-1000pg/mL 5.86pg/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、抗體濃度**性及經(jīng)濟性**評價。
豬甲胎蛋白(αFP)ELISA試劑盒 porcine Alpha-Fetoprotein (aFP) ELISA Kit 78.125-5000pg/mL 27pg/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬激活蛋白C(APC)ELISA試劑盒 porcine Activated Protein C (APC) ELISA Kit 0.156-10ng/mL 0.052ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬基質(zhì)細胞衍生因子1(SDF1)ELISA試劑盒 porcine Stromal Cell Derived Factor 1 (SDF1) ELISA Kit 0.625-40ng/mL 0.245ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)ELISA試劑盒 porcine Matrix Metalloproteinase 9 (MMP9) ELISA Kit 1.563-100ng/mL 0.56ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)ELISA試劑盒 porcine Matrix Metalloproteinase 3 (MMP3) ELISA Kit 4.688-300ng/mL 1.8ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬基質(zhì)金屬蛋白酶23B(MMP23B)ELISA試劑盒 porcine Matrix Metalloproteinase 23B (MMP23B) ELISA Kit 3.125-200 ng/mL 1.2 ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)ELISA試劑盒 porcine Matrix Metalloproteinase 2 (MMP2) ELISA Kit 78.125-5000pg/mL 33pg/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。
豬基質(zhì)金屬蛋白酶15(MMP15)ELISA試劑盒 porcine Matrix Metalloproteinase 15 (MMP15) ELISA Kit 0.313-20 ng/mL 0.094 ng/mL 試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、**性及經(jīng)濟性**評價。