**印跡的基本原理、實(shí)驗(yàn)步驟

Western Blot原理

       Western Blot（**印跡）采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。SDS-PAGE可對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質(zhì)，并保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的NC膜就稱(chēng)為一個(gè)印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉NC膜上的疏水結(jié)合位點(diǎn)。用目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）處理NC膜——只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，只有在目標(biāo)蛋白的位置上結(jié)合著一抗。用一抗處理過(guò)的NC膜再用標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。
       Western Blot實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
       1.試劑準(zhǔn)備
      （1）甲醇
      （2）轉(zhuǎn)移緩沖液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）
      （3）一抗，二抗
      （4）PBST，PBS，Tween-20
      （5）顯影液（5X）：
       自來(lái)水（加熱至 50℃） 375ml （以下藥品加到溫水中）
       米吐?tīng)?1.55g， 亞硫酸鈉（無(wú)水） 22.5g， 碳酸鈉（無(wú)水） 33.75g， 溴化鉀 20.95g，補(bǔ)水至 500ml
      （6）定影液：
       自來(lái)水（50～60℃） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）
       硫代硫酸鈉 240g， 亞硫酸鈉（無(wú)水） 15g， 冰乙酸 12.6ml，硼酸 7.5g，鉀明礬 15g（水溫冷至 30℃以下時(shí)再加入），加水定容至 1000ml，室溫保存
       2. 材料準(zhǔn)備
       轉(zhuǎn)膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支滴管，兩張濾紙，一張PVDF膜，轉(zhuǎn)膜槽，轉(zhuǎn)移電泳儀，搖床，計(jì)時(shí)器，磁力攪拌器，轉(zhuǎn)子，Western blot 盒，一塊SDS-PAGE膠，脫脂奶粉
       實(shí)驗(yàn)步驟

       1.將玻璃板洗凈，*后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。 
       2.分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過(guò)濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4℃，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過(guò)程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡），加入10%AP及TEMED即可。 
       3.封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度＜10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時(shí)用異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS，封膠后靜置至膠凝固。待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過(guò)降低張力**殘留水滴。
       4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)防止氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正。30min后上樣，長(zhǎng)時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。(10%的AP*好現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過(guò)兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，*好棄掉) 

       (二) 樣品處理 
       培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）  
       1.去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。 
       2.對(duì)于6孔板來(lái)說(shuō)每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 
       3.刮下的細(xì)胞在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。 
       4.用干凈的針尖挑絲，將團(tuán)塊棄掉，如果沒(méi)有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，可將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無(wú)團(tuán)塊也無(wú)絲狀物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反復(fù)抽吸來(lái)降低溶液粘滯度，便于上樣。 
       5.待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。 
 
        培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）  
       1.去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。 
       2.加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。 
       3.刮下的細(xì)胞收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。 
       4.12000g離心，4℃，2min。 
       5.取少量上清進(jìn)行定量。 
       6.將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣*好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。 
       3. 組織  
       1.心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液?？墒謩?dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 
       2.12000g離心，4℃，2min。 
       3.取少量上清進(jìn)行定量。 
       4.將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣*好，低溫儲(chǔ)存剩余溶液（溶于1×loading buffer），每次上樣前98℃，3min。 
 
       (三) SDS-PAGE電泳(不用染色)  
       使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。關(guān)于SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)操作原理及FAQ參考  

       (四) 轉(zhuǎn)膜

       電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開(kāi)始準(zhǔn)備  
       1、準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)移緩沖液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g  SDS 0.37g 甲醇200ml  V=1L）、轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支滴管、2張濾紙、一張PVDF膜。 
       2、剪切濾紙和膜時(shí)一定要戴一次性PE手套，避免手上的蛋白污染膜。轉(zhuǎn)膜前，PVDF膜應(yīng)在甲醇溶液中浸泡5-10秒，浸濕為止，在平衡液中平衡（甲醇的作用是固定大分子蛋白，使小分子物質(zhì)易轉(zhuǎn)移出去） 
       3、將轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支滴管、2張濾紙、一張PVDF膜浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中，然后取出SDS-PAGE膠，將濃縮膠輕輕刮去，并在膠的一角做一缺角作為標(biāo)記以區(qū)分上樣順序。將膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min左右，以平衡離子強(qiáng)度。 
       4、夾子打開(kāi)平放底部黑色電極(陰極)，放一張海綿墊片，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。在海綿墊片上放置1張轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙，對(duì)齊，然后用一玻璃棒作滾筒以擠出所有氣泡，必要時(shí)可滴加轉(zhuǎn)膜液潤(rùn)濕。取出浸在轉(zhuǎn)膜液中的凝膠平放在濾紙上，排除所有氣泡。將PVDF膜置于聚丙烯酰胺凝膠上，玻棒來(lái)回?fù){幾遍排除所有氣泡，注意在膜的正面作上標(biāo)記（可以將膜的一角剪去或用簽字筆在膜的邊角上做記號(hào)）。在膜上蓋一張轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過(guò)的濾紙，同樣須確保不留氣泡。*后蓋上另一張海綿墊，蓋上陽(yáng)極板（白色），夾緊。保證對(duì)凝膠有一定壓力。 
       5、將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。轉(zhuǎn)膜時(shí)將轉(zhuǎn)移槽放入冰水中進(jìn)行。轉(zhuǎn)膜過(guò)程中電轉(zhuǎn)液用磁力攪拌器攪拌。一般用恒壓110V轉(zhuǎn)移60min。對(duì)于大分子量的蛋白（超過(guò)120KD），時(shí)間約80min。特別要注意加強(qiáng)降溫措施。 
       (五) **學(xué)檢測(cè) 
       1、 取膜，將膜正面朝上在1xPBST溶液中搖動(dòng)五分鐘，洗一次，移至含有封閉液（含10％脫脂奶粉的 瓶PBST 緩沖液；脫脂奶粉5g，PBST 100ml，溶解后 4℃保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過(guò)膜面即可，一次性使用。）的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1小時(shí)。注：10%脫脂牛奶的作用：用大分子物質(zhì)封閉非相關(guān)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，降低非特異性結(jié)合（抗體與膜），同時(shí)也使背景色不高。PBST：T為吐溫，減少非特異性吸附，不影響抗體抗原的結(jié)合。 
       2、 取出膜在1xPBST溶液中洗5分鐘，搖動(dòng)，洗兩次，放入1xPBST緩沖液中（內(nèi)含5%脫脂牛奶），同時(shí)加入一抗與二抗到緩沖液中，孵育60min。 
       3、 用1xPBST洗至少三次，5min/次 
       4、 化學(xué)發(fā)光，顯影。顯影液與水1:4，定影液與水1:9，發(fā)光液 
       注：顯影液（5X）： 
       自來(lái)水（加熱至 50℃） 375ml （以下藥品加到溫水中） 
       米吐?tīng)?1.55g 
       亞硫酸鈉（無(wú)水） 22.5g 
       碳酸鈉（無(wú)水） 33.75g 
       溴化鉀 20.95g 
       補(bǔ)水至 500ml 
       配制時(shí)，上述藥品應(yīng)逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4℃保存。使用時(shí)用自來(lái)水稀釋至 1 倍。 
       定影液： 
       自來(lái)水（50～60℃） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者） 
       硫代硫酸鈉 240g 
       亞硫酸鈉（無(wú)水） 15g 
       冰乙酸 12.6ml 
       硼酸 7.5g 
       鉀明礬 15g（水溫冷至 30℃以下時(shí)再加入） 
       加水定容至 1000ml，室溫保存 
       發(fā)光液：魯米諾試劑2ml、過(guò)氧化氫1.3ml 

       5、 在暗室中，將 1×顯影液（50ml）和定影液（50ml）分別到入塑料盒中；在紅燈下取出 X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大小（比膜的長(zhǎng)和寬均需大 25px）；打開(kāi) X-光片夾，將膜放入X-光片夾，并將發(fā)光液均勻涂抹在膜上，之后把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上 X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為 1min 或 5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)*佳效果；曝光完成后，打開(kāi) X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為 1～2min（20～25℃），溫度過(guò)低時(shí)（低于 16℃）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把 X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為 5～10min，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。

       (六) 注意事項(xiàng)  

       1.顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，手指甲不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。 

       2.一抗，二抗的孵育時(shí)間因抗體不同可做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。 
       3.轉(zhuǎn)膜時(shí)濾紙與膠，膠與膜，膜與濾紙之間不能有氣泡，必須用玻棒搟走。有氣泡會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效果。 
       4.把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)