細胞培養(yǎng)相關(guān)問題及解答

小牛血清和胎牛血清有何區(qū)別？應(yīng)用注意事項？

來源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰懷孕母牛的時候,通過心臟穿刺采血獲取的胎牛的血清，新生牛（小牛）血清（Calf serum, CS）采自出生10至14 天的小牛。

組份與比例不同：兩者所含的促細胞生長因子、促貼附因子、**及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同，用途與用法不同：某些細胞必需胎牛血清才能生長，而有些細胞只需小牛血清即可，使用濃度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。

血清保存和使用須注意：血清應(yīng)保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超過一個月。解凍血清時，應(yīng)先將血清至于2-8℃冰箱，并經(jīng)常搖勻使之溶解，然后至室溫放置使之升溫，**不可將冷凍的血清直接放入37℃水浴或者溫箱中，如放在37℃解凍，顏色加深，粘稠度也會增加，血清在解凍和熱滅活后，應(yīng)按用量分裝并于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

胰酶消化傳代的濃度是多少？是否含EDTA？濃度？

胰酶消化傳代的一般濃度為0.25%，部分細胞由于貼壁較緊，需要加0.53mM 的EDTA，如果做原代培養(yǎng)，胰酶的濃度需要做適當?shù)奶岣摺?

常用細胞株推薦的培養(yǎng)基及特殊要求？

常規(guī)培養(yǎng)基的選用一般原則，懸浮培養(yǎng)細胞以RPMI1640為主、貼壁培養(yǎng)的細胞以DMEM為主，部分細胞需用特殊培養(yǎng)液來培養(yǎng)，如Mccoy’5A、L-15、F12K、D+F12 等等。

細胞株的污染鑒定、預(yù)防和處理問題。

普通微生物污染：培養(yǎng)基渾濁，高倍鏡觀察有微生物污染；按規(guī)定棄用并**嚴格**。

支原體污染：顯微鏡無法觀察，依經(jīng)驗表現(xiàn)為細胞生長緩慢，有細胞漂浮等等，應(yīng)通過pcr 等方法鑒定，如發(fā)現(xiàn)支原體污染，應(yīng)按規(guī)定棄用，實驗室要及時******，防止蔓延。（有些常規(guī)性細胞學(xué)實驗不受支原體污染影響，可以繼續(xù)使用細胞傳代，為防污染擴大蔓延，可以選擇性的在培養(yǎng)基中加入高效價的其它種***，并在隔離實驗室操作和獨立使用一切用具與培養(yǎng)基等）。

如何傳代貼壁細胞？

細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。

懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化貼壁細胞成單個細胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一種二價離子的螯合劑，能抑制細胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca2+和Mg2+的鹽溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗細胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后棄去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask)，觀察細胞直到細胞變圓脫離瓶壁，此過程一般需要5-15分鐘，為了避免細胞成團，消化細胞的過程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進消化，細胞脫離瓶壁后，立刻加入含有血清的完全培養(yǎng)基中止消化，血清中某些蛋白質(zhì)能夠抑制胰酶的活性。

一般情況下，離心并不需要。如果細胞需要無血清或者低血清的培養(yǎng)基，可以以125000g 轉(zhuǎn)速離心5分鐘，然后棄去中止用的培養(yǎng)基，加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細胞，移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細胞類型而定，一般是1:2-1:20，具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細胞的細胞膜產(chǎn)生損傷，對于這種類型的細胞，可用細胞刮輕輕刮下細胞，加入適量的培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細胞，然后進行傳代培養(yǎng)。

傳代細胞的頻率多久較合適？

傳代是指把細胞從一個培養(yǎng)瓶移到另一個培養(yǎng)瓶，傳代的間隔是指兩次傳代之間的時間。

貼壁型的細胞的匯合度達到或者接近100%的時候，需進行傳代操作，但是，有些細胞以克隆的形式生長，匯合度永遠達不到100%，對于這種類型的細胞，細胞達到或者接近*大密度的時候，就需傳代。接觸抑制型細胞（比如3T3）需要在細胞長滿之前傳代以避免產(chǎn)生細胞長滿后接觸抑制后產(chǎn)生性狀的改變。懸浮型的細胞必須在細胞達到*大飽和密度之前傳代，懸浮細胞傳代時只需稀釋至合適的密度，讓細胞有充足的營養(yǎng)恢復(fù)到對數(shù)生長期。

如果僅僅是簡單的換液，而且細胞數(shù)量不減少，細胞將會快速耗盡營養(yǎng)而死亡；如果細胞稀釋到*低密度之下，細胞將會進入停滯期而不增殖或者死亡。不同的懸浮細胞的*大飽和密度和傳代的間隔與比例是不同的，所以，培養(yǎng)懸浮細胞要每日觀察。

如何處理對于生物**性不清楚地腫瘤細胞株？

了解每株細胞可能產(chǎn)生的生物危害是很難的，但是強烈推薦，所有的人類和其他靈長類生物的細胞在能否預(yù)防HIV和肝炎病毒的實驗條件下操作，所有的操作必須在垂直層流超凈臺內(nèi)操作（推薦生物**柜），操作過程中產(chǎn)生的廢液和廢儀器都要經(jīng)過清洗、酸處理等處理后才能丟棄。

能否使用細胞說明書上不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞？

產(chǎn)品目錄或者細胞說明書上的推薦的培養(yǎng)基一般是細胞株的原始提供者推薦的培養(yǎng)基或者已經(jīng)經(jīng)過驗證的對該細胞株*合適的培養(yǎng)基，細胞對未推薦的培養(yǎng)基也許會適應(yīng)，也有可能不適應(yīng)。對于更換培養(yǎng)基，應(yīng)謹慎對待，更換培養(yǎng)基時，應(yīng)留一瓶細胞使用推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng)，留作種子。

更換培養(yǎng)基有兩種方法，*簡單的方法是直接更換培養(yǎng)基，強制使細胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基；還有一種更溫和的方法：傳代細胞的時候分成細胞兩瓶，**瓶使用原來推薦的培養(yǎng)基，**瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，之后仔細觀察細胞的生長狀態(tài)，如果**瓶細胞生長狀態(tài)不好，應(yīng)立即停止更換培養(yǎng)基，如果**瓶生長狀態(tài)好，可以繼續(xù)傳代分瓶，一瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基，50%新的培養(yǎng)基，另一瓶使用25%原來推薦的培養(yǎng)基，75%新的培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察，如果細胞狀態(tài)好，可以全部換成新鮮的培養(yǎng)基。