細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡介
細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡介
細(xì)胞轉(zhuǎn)染，是指將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種技術(shù)。根據(jù)哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)流程，細(xì)胞培養(yǎng)完成后需進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的轉(zhuǎn)染方法。目前，常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法主要分為三類途徑：物理介導(dǎo)（電穿孔法，基因槍法、顯微注射法）、化學(xué)介導(dǎo)（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物介導(dǎo)法）、生物介導(dǎo)（病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染）。
理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)室常用的轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)染，不同的轉(zhuǎn)染方法各有利弊，針對細(xì)胞的習(xí)性和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目蛇x擇相對合適的轉(zhuǎn)染方法。
一般來說，原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染難度是比較大的，雖然眾所周知，原代細(xì)胞研究具有非常重要的生物學(xué)意義，但是轉(zhuǎn)染效率低下一直是制約其發(fā)展的主要因素。
本文我們主要介紹一種常用的適用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。
---陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。
常用的脂質(zhì)體主要有兩種，Lipofectin和Lipofectamine。前者是一種陽離子脂質(zhì)試劑，可與靶DNA的磷酸骨架結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能輕易通過細(xì)胞膜從而完成轉(zhuǎn)染過程。Lipofectin可用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和寡核苷酸至各種動物細(xì)胞，并可將DNA導(dǎo)入植物原生質(zhì)體。Lipofectamine是一種多陽離子轉(zhuǎn)染試劑，其頭部具獨(dú)特的精胺基團(tuán)，該基團(tuán)的強(qiáng)負(fù)電子性使Lipofectamine具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)染能力。
實(shí)驗(yàn)步驟
(一)貼壁細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)染
1. 在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種2ml(完全培養(yǎng)基)約1.3×105細(xì)胞。
2. 37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至50-80％豐度。
3. 在兩個1.5ml離心管中準(zhǔn)備如下溶液：
溶液A：溶1-2 μg DNA于100μl無血清培養(yǎng)基中
溶液B：溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)于100μl無血清培養(yǎng)基中
4. 將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。此時可將細(xì)胞用2ml無血清培養(yǎng)基漂洗1-2遍。
5. 混合的A、B兩液中加入0.8ml無血清培養(yǎng)基，混勻，平鋪在漂洗過的細(xì)胞上。如果細(xì)胞對無血清耐受能力差，這一步可加入血清。但是在轉(zhuǎn)染過程中不要加入***(antibiotic)。
6．37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時。
7. 加入lml培養(yǎng)基(含兩倍于正常濃度的血清)。若血清已加入，這一步可加入lml正常的完全培養(yǎng)基。
8. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時換入新鮮的完全培養(yǎng)基。
9．根據(jù)細(xì)胞類型及啟動子的活性，在24-72小時可對基因的表達(dá)活性進(jìn)行分析。
10. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時，可將細(xì)胞按1:10傳入選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。
(二)瞬時轉(zhuǎn)染
1. 用無血清、無***(antibiotic)的培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞1-2遍。
2．在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種0.8ml(無血清培養(yǎng)基)約2-3×106細(xì)胞。
3. 在兩個1.5ml離心管中準(zhǔn)備如下溶液：
溶液A：溶1-2μgDNA于100μl無血清培養(yǎng)基中
溶液B：溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)無血清培養(yǎng)基中
4．將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。
5．將混合液加入細(xì)胞懸液中，混勻，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時。
6．加入4ml完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)24-72小時．
7．倒掉培養(yǎng)基，藍(lán)光激發(fā)下觀察綠色熒光。
