著床前小鼠胚胎線粒體功能障礙對(duì)著床胚胎與胎盤發(fā)育的影響

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 胚胎培養(yǎng)基

用含4mg/ml BSA的MOPS-G1工作液收集受精卵。胚胎培養(yǎng)液分對(duì)照組培養(yǎng)液與試驗(yàn)組培養(yǎng)液(G1.2/G2.2，注：G1.2為對(duì)照組培養(yǎng)液；G2.2為試驗(yàn)組培養(yǎng)液)，其基本物質(zhì)有：維生素和主要的氨基酸以及5%的人血清白蛋白(HSA)。試驗(yàn)組培養(yǎng)液不含有主要的丙酮酸鹽，添加或不添加梯度的(0.5-500μm)線粒體MAS抑制劑Amino-oxyacetate(AOA)。此試驗(yàn)組培養(yǎng)液用來引起著床前胚胎不同水平的代謝紊亂。

2. 動(dòng)物和胚胎收集

21日齡雌鼠CBAxC57BL/6腹腔注射5 IU eCG，48h后注射5 IU hCG，然后與公鼠CBAxC57BL/6合籠。見栓雌鼠，在hCG注射22h后脫頸處死，取輸卵管，在MOPS-G1工作液中撕破膨大部，釋放出卵丘卵母細(xì)胞，用0.5 mg/ml的透明質(zhì)酸酶作用30s，獲得裸卵。

3. 胚胎培養(yǎng)及線粒體功能抑制的體外模型獲得

每20μl G1.2培養(yǎng)液放10枚受精卵，在37℃、5%O₂、6%CO₂條件下過夜培養(yǎng)。

培養(yǎng)22h后，獲得的二細(xì)胞胚胎隨機(jī)的分成三組，并用相應(yīng)的培養(yǎng)液清洗：1)對(duì)照組：G1.2培養(yǎng)液(C)，2)不含丙酮酸鈉的G1.2培養(yǎng)液，以使胚胎的代謝發(fā)生改變，3)含有0.5，5，50 或500μM 抑制劑AOA、不含丙酮酸鈉的G1.2培養(yǎng)液，以抑制線粒體的MAS功能。二細(xì)胞胚胎在相應(yīng)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，然后分別換相應(yīng)的G2.2培養(yǎng)液(±丙酮酸鈉和AOA)進(jìn)行培養(yǎng)，直到囊胚階段(第5d)。在第四天和第五天統(tǒng)計(jì)的胚胎發(fā)育率與第五天統(tǒng)計(jì)的囊胚情況進(jìn)行評(píng)估分析。

4. 囊胚細(xì)胞數(shù)目與細(xì)胞分配的分析

用Hardy 等的試驗(yàn)方法，統(tǒng)計(jì)囊胚滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)目。孵化期前，囊胚在4℃10mM TNBS中10min，然后在37℃ 0.1mg/ml anti-DNP-BSA中10min，后用37℃黑暗孵育5min以標(biāo)記滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的核；要進(jìn)一步標(biāo)記ICM和TE細(xì)胞，用含6μg/ml雙苯甲亞胺的乙醇處理，過夜。**天，胚胎用無水乙醇清洗，用甘油包埋，再在紫外熒光顯微鏡下觀察。記錄TE細(xì)胞(粉色)和ICM細(xì)胞(藍(lán)色)的數(shù)目，并計(jì)算TE/ICM的比率。

5. 計(jì)算囊胚細(xì)胞凋亡

用一種原位細(xì)胞死亡診斷盒來評(píng)估囊胚的凋亡。凋亡細(xì)胞核用末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)進(jìn)行熒光標(biāo)記；用碘化丙啶標(biāo)記所有的細(xì)胞。細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞核的數(shù)目可以用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察記錄；計(jì)算凋亡細(xì)胞的數(shù)目/相應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)得到凋亡細(xì)胞指數(shù)。

6. 計(jì)算呼吸率

每枚囊胚的呼吸率被視為線粒體氧化磷酸化能力的一個(gè)指標(biāo)，呼吸率是用胚胎鏡檢測(cè)的。用12孔板，每孔中放一枚囊胚；每枚囊胚用各自的培養(yǎng)液作為工作液。將12孔板放到胚胎鏡中，自動(dòng)記錄O₂消耗量(呼吸率)。當(dāng)胚胎消耗氧氣時(shí)，它能夠在小孔中產(chǎn)生線性的濃度梯度。每個(gè)小孔中的氧氣濃度事先用一種自動(dòng)微傳感器進(jìn)行了**的周期性測(cè)量，以檢測(cè)其線性梯度。這濃度梯度用來測(cè)量單枚胚胎的呼吸率。胚胎的氧氣消耗量，大約每小時(shí)測(cè)量一次，連續(xù)測(cè)量三個(gè)小時(shí)；呼吸率為這三小時(shí)獲得的每枚囊胚每秒鐘消耗的氧氣飛摩爾質(zhì)量(fmol/sec)。

7. 碳水化合物代謝分析

利用之前所述方法，檢測(cè)每枚胚胎經(jīng)糖酵解途徑的葡萄糖氧化率和經(jīng)TCA循環(huán)途徑的丙酮酸鹽代謝率。每個(gè)1.6ml的離心管中放一枚囊胚，然后加入2μl相應(yīng)的G2.2培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含0.5 μCi的[5-3H]葡萄糖(比活力為88.4mCi/mg)或0.35 μCi 的D-[6-14C]葡萄糖(比活力為302 μCi/mg)。糖酵解率和TCA途徑代謝率分別利用3H₂O 和 14CO₂的產(chǎn)生獲得，并用pmol/h表示。[加的都是葡萄糖，為什么說檢測(cè)TCA途徑的丙酮酸鹽代謝率呢？TCA起始物是丙酮酸吧？葡萄糖可轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽]。

8. ATP和ADP的測(cè)定

利用Mitchell等的方法檢測(cè)每枚囊胚的ATP、ADP以及ATP:ADP水平。每枚胚胎用100nl含有1mg/ml蔗聚糖的MOPS-G1萃??；然后用20nl 3M高氯酸黑暗孵育10min；之后用80nl 冰 KHCO₃(2M)中和高氯酸。利用己糖激酶和6-磷酸葡糖脫氫酶催化的酶聯(lián)**反應(yīng)或者乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶催化的酶聯(lián)**反應(yīng)，經(jīng)過萃取，用熒光顯微鏡分別對(duì)ATP和ADP濃度進(jìn)行定量分析。ATP和ADP的濃度利用相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，并用(pmol/每枚胚胎)表示。

9. 胚胎移植

6-12周齡的瑞士雌鼠與結(jié)扎公鼠合籠，假孕母鼠懷孕3.5天進(jìn)行胚胎移植，每只假孕母鼠每側(cè)**移入6枚囊胚期胚胎。每只假孕母鼠，隨機(jī)的一側(cè)**移入對(duì)照組胚胎，另一側(cè)移入試驗(yàn)組胚胎(-P或是AOA)。胚胎的著床能力在小鼠懷孕的第18天，通過著床胚胎數(shù)量以及胚胎和胎盤情況的檢測(cè)來評(píng)價(jià)。