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新工具幫科學家看到活細胞蛋白質(zhì)
日期：2024-08-29 10:25
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摘要：
生物物理學家Joerg Bewersdorf說，2006年是熒光顯微鏡學的奇跡之年。而與之相媲美的另一個年份是1905年，當時愛因斯坦以相對論、量子論和原子物理學變革了物理領(lǐng)域。而這場顯微鏡學**，則是由3篇論文組成的，科學家**能窺見細胞內(nèi)部并追蹤單個分子的行為。
“每個分子是一臺機器，一臺納米機器?！盉ewersdorf說。其中，蛋白質(zhì)是尤為復雜的分子，它們以多種方式彎曲纏繞，執(zhí)行細胞新陳代謝和生長需要的反應?！拔覀兏信d趣的是，這些微型機器是如何整合在一起完成細胞機能的？”
長期以來，光學顯微成...
生物物理學家Joerg Bewersdorf說，2006年是熒光顯微鏡學的奇跡之年。而與之相媲美的另一個年份是1905年，當時愛因斯坦以相對論、量子論和原子物理學變革了物理領(lǐng)域。而這場顯微鏡學**，則是由3篇論文組成的，科學家**能窺見細胞內(nèi)部并追蹤單個分子的行為。
“每個分子是一臺機器，一臺納米機器。”Bewersdorf說。其中，蛋白質(zhì)是尤為復雜的分子，它們以多種方式彎曲纏繞，執(zhí)行細胞新陳代謝和生長需要的反應?！拔覀兏信d趣的是，這些微型機器是如何整合在一起完成細胞機能的？”
長期以來，光學顯微成像技術(shù)的發(fā)展一直受制于一個物理極限值的約束，也就是德國物理學家、顯微技術(shù)專家恩斯特·阿貝在1873年提出的預言：光學顯微鏡的成像效果被認為受到光的波長限制，無法突破0.2微米，即光波長1/2的分辨率極限，此后被稱為“阿貝分辨率”。
在能夠窺見細胞內(nèi)部之前，科學家對該問題并沒有清晰的答案。光學顯微鏡無法提供任何幫助，超越一定放大率后，衍射使得光線四散而非集中于一點。任何距離小于200納米或?qū)挾仁羌毎?0倍的物體都會變成一個模糊點。使用電子顯微鏡制作的圖片能分辨精細結(jié)構(gòu)，但必須是靜態(tài)的，無法用于活細胞。
2006年，3個實驗室各自采用相似策略克服了“衍射障礙”：利用專業(yè)的熒光探針分析樣本。這些探針能被有選擇地開啟，直到所有探針能在一系列圖像中被捕捉到?？茖W家能像印象派畫家利用顏色點構(gòu)建一個場景那樣將這些圖像制作成一張圖片。這3個技術(shù)——光敏定位顯微鏡（PALM）、熒光PALM（FPALM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM），能區(qū)分出相距20納米的目標，產(chǎn)生單分子尺度的熒光照片。這些技術(shù)為研究人員插上前進的翅膀。例如，Bewersdorf在美國耶魯大學的實驗室正為活動在活細胞表面的蛋白質(zhì)“照相”。
自2006年到現(xiàn)在的10年間，這3個技術(shù)掀起了技術(shù)和方法的革新浪潮。2014年，德國馬克斯普朗克學會生物物理化學研究所的Stefan Hell、美國霍華德·修斯醫(yī)學院珍妮莉婭法姆研究院的Eric Betzig和美國斯坦福大學的William Moerner提出的打破衍射極限的成像策略使他們成為諾貝爾化學獎得主。研究人員目前正在制造更明亮的熒光探針，以便照亮未曾展現(xiàn)在人們面前的細胞進程。
“令人興奮的是，這些技術(shù)讓觀察活細胞成為可能?！闭淠堇驄I法姆研究學院Jennifer Lippincott-Schwartz說，“目前，使用熒光探針拍攝單個蛋白質(zhì)時機已經(jīng)成熟?！?/span>
更持久、更明亮
這3個超分辨率顯微鏡技術(shù)都是依靠綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）等化合物發(fā)出光線的。這些物質(zhì)的基因能**入編碼細胞蛋白質(zhì)的基因中。然后，生成的蛋白質(zhì)中則附著著熒光物質(zhì)，并通過發(fā)出熒光顯示其存在位置。
但這些技術(shù)均存在限制。一個大問題是，在被刺激其發(fā)光的激光徹底損壞前，這些探針只能發(fā)出極為有限的光。甚至在光褪色效應發(fā)生前，探針的光已經(jīng)非常微弱了。
而這些探針的綜合版本有機染料，能發(fā)出更明亮的光，但卻無法編碼目標基因，并插入細胞內(nèi)部。相反，它們通常與能找到蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合在一起。但這種組合使得探針過大，無法穿過細胞膜或干擾蛋白質(zhì)功能?！斑@些探針確實存在限制?！盉ewersdorf說。
幸運的是，革新正在出現(xiàn)。Bewersdorf團隊正在與兩個團隊合作研究可點擊化學探針：新英格蘭生物實驗室的SNAP-tag和普洛麥格生物技術(shù)公司的HaloTag。這些技術(shù)包含一種能被編碼到興趣蛋白質(zhì)中的較短的靶序列和一個能通過簡單化學反應嵌入靶蛋白中的染色分子。Bewersdorf和同事已經(jīng)證明這兩種技術(shù)能使用有機染料作用于活細胞。
另外，研究人員還求助于量子點——納米級半導體。這種物質(zhì)不僅明亮且持續(xù)一個月甚至更久，還能與生物分子相連接。新墨西哥大學生物物理學家Diane Lidke在細胞傳導實驗中就使用了量子點。但量子點存在一個缺點：體積過大。市場上能買到的量子點都有一個殼，這讓其直徑大了15~25納米。與只有4納米寬的熒光蛋白質(zhì)相比，“它們太大太笨重了”。
這一缺點意味著研究人員很難將量子點放入細胞或其他緊密空間中，但能有效應用于在細胞外基質(zhì)和膜結(jié)合蛋白中。在與其丈夫、該校物理學家Keith Lidke的合作中，Lidke開發(fā)出了多色、快速、單分子追蹤技術(shù)，能用量子點在定制顯微鏡中生產(chǎn)圖片。
打開細胞
穿越細胞膜是熒光顯微鏡面臨的*大障礙之一?！凹幢阒挥?納米厚，細胞膜已經(jīng)進化了數(shù)十億年，以便隔離細胞內(nèi)外，而且，效果出奇地好?！币晾Z伊大學香檳分校生物物理學家Paul Selvin說。
Selvin的實驗室開發(fā)出的量子點更小，直徑接近9納米。這一尺寸能讓他將量子點滑過神經(jīng)細胞之間20~40納米的空隙，信息傳導分子經(jīng)由這里向相鄰神經(jīng)細胞傳遞信息。一旦進入這里，量子點能束縛并突出幫助記憶形成的受體的存在。雖然Selvin并沒有將這些量子點植入活細胞內(nèi)，但他認為這是可行的。
該實驗室還計劃在細胞膜上穿孔，然后迅速密封起來，以避免破壞細胞?！拔覀兡軌蚴褂靡环N名為鏈球菌溶血素的**酶在細胞膜上鉆一個約5納米的微小孔洞?！盨elvin說。這一寬度足以讓熒光蛋白質(zhì)通過，甚至是聯(lián)合了抗體的蛋白質(zhì)，以便尋找細胞內(nèi)部的目標物體。之后，研究人員能利用尚未發(fā)表的方法在20分鐘內(nèi)修補這些孔洞。
另外，還有人擔憂，這些探針會干擾靶蛋白的功能。而約翰斯·霍普金斯大學生物物理學家Jie Xiao則提出了一個不會損傷這些蛋白質(zhì)的替代方案。
她的探針分子經(jīng)過基因修飾，并非附著在目標分子上，它們被制作出來后，就立刻被一種酶劈開，并進入細胞膜的一個特定位置。這就意味著它們不再攜帶靶分子的位置信息，但卻位于能對其進行**計算的位置，并由此獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)生的**計數(shù)，同時，蛋白質(zhì)本身能自由發(fā)揮功能。Xiao將該技術(shù)稱為裂解共轉(zhuǎn)化活化（CoTrAC）。
“量化活細胞的蛋白質(zhì)水平非常重要?！盭iao解釋道，“人們通常使用熒光指示出相對變化。”但其研究的基因調(diào)控蛋白質(zhì)極少，很難用超分辨計數(shù)成像。此外，這些蛋白質(zhì)的**數(shù)字的細微變化也能判斷細胞狀態(tài)改變與否。
讓背景暗下去
除了更明亮，另一個讓探針脫穎而出的方法是降低背景亮度。德國波恩大學生物物理化學家Ulrich Kubitscheck表示，“細胞中也有擴散的背景?！狈前械鞍咨踔帘旧砭陀刑烊弧档臒晒?，這就造成了背景噪音。如果減少背景噪音，圖像的清晰度就會提高。
因此，研究人員不斷改進亮度策略。Kubitscheck實驗室使用激光層照顯微技術(shù)生產(chǎn)一個非常細的**聚焦光束，該光束能從側(cè)面穿過樣本。“我們建造了一些下部和四周透明的玻璃室?！彼f。通過從側(cè)面而非頂部向樣本照射光線，該團隊照亮了一個200~300納米厚的切片，并從下部對樣本進行觀察?？茖W家利用這種方法，看到RNA分子經(jīng)過一種名為核膜孔的蛋白質(zhì)絡(luò)合物輸出，進入細胞質(zhì)。在這里，它們開始指揮蛋白質(zhì)合成。
能進行激光層成像的顯微鏡已經(jīng)商業(yè)化。具備專業(yè)知識的研究團隊已經(jīng)組成，并開始定制自己的顯微鏡。
而下一代選擇性平面照明顯微術(shù)被稱為晶格光片顯微鏡，誕生自Betzig的實驗室。項目合作者、珍妮莉婭法姆研究院細胞生物學家Zhe Liu說，該技術(shù)能產(chǎn)生300~500納米厚的照明平面，其優(yōu)點在于光點的結(jié)構(gòu)。晶格能形成一個三維網(wǎng)格，照亮樣本的連續(xù)剖面。
總之，顯微鏡技術(shù)在生物學發(fā)展歷程中至關(guān)重要，尤其是早期顯微術(shù)領(lǐng)域的某些重要發(fā)現(xiàn)，直接促成了細胞生物學及其相關(guān)學科的突破性發(fā)展。隨著生命科學的研究由整個物種發(fā)展到分子水平，顯微鏡的空間分辨率及鑒別精微細節(jié)的能力已經(jīng)成為關(guān)鍵技術(shù)問題。光學顯微鏡的發(fā)展史就是人類不斷挑戰(zhàn)分辨率極限的歷史。
