**細(xì)胞凍存復(fù)蘇技術(shù)
1. 細(xì)胞凍存復(fù)蘇技術(shù)簡介
在ELISPOT檢測的應(yīng)用中,往往需要用到凍存的**細(xì)胞樣品作為檢測細(xì)胞。由于ELISPOT檢測的是細(xì)胞的**功能,不僅僅需要保持細(xì)胞的存活率,而且還要保證細(xì)胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法通常是為了保存細(xì)胞株,對細(xì)胞存活率的要求不高,更沒考慮保持細(xì)胞原有的**狀態(tài),所以傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法已經(jīng)不能滿足ELISPOT檢測的要求。參見圖7.1。
考慮到ELISPOT檢測的特殊性,荷蘭U-CyTech公司經(jīng)過精心的研究與反復(fù)的驗證,推出了Cryostar?凍存試劑盒,在凍存液中添加了一系列對細(xì)胞有特殊保護(hù)作用的保護(hù)劑。達(dá)科為公司在接到Cryostar?凍存試劑盒之后,在我們的實驗室以及國內(nèi)數(shù)家客戶的實驗室做了細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的實驗,并且對復(fù)蘇之后的細(xì)胞做了ELISPOT檢測。結(jié)果表明,**細(xì)胞的存活率超過90%,ELISPOT斑點形成頻率與新鮮細(xì)胞完全相同。參見圖6.1。
2005年底,在達(dá)科為公司與中國生物制品檢定所合作制備凍存的質(zhì)控細(xì)胞庫時,Cryostar?2005年底,在達(dá)科為公司與中國生物制品檢定所合作制備凍存的質(zhì)控細(xì)胞庫時,Cryostar?凍存試劑盒與本文的凍存復(fù)蘇技術(shù)經(jīng)受住了嚴(yán)格的考驗,細(xì)胞存活率達(dá)到95%。這表明,該項技術(shù)已經(jīng)完全成熟,可以用于建立大型凍存細(xì)胞庫(108-109cells)。
凍存試劑盒與本文的凍存復(fù)蘇技術(shù)經(jīng)受住了嚴(yán)格的考驗,細(xì)胞存活率達(dá)到95%。這表明,該項技術(shù)已經(jīng)完全成熟,可以用于建立大型凍存細(xì)胞庫(108-109cells)。
根據(jù)我們的實驗經(jīng)驗,**的細(xì)胞凍存效果需要上等的凍存試劑盒加上嚴(yán)格規(guī)范的實驗操作。二者缺一不可,不可偏頗,千萬不要因為有了好的試劑盒而放松對實驗操作的要求。為了幫助國內(nèi)的客戶解決好細(xì)胞凍存的問題,達(dá)科為公司以Cryostar? 凍存試劑盒使用說明為例特此編撰這份詳細(xì)的細(xì)胞凍存、復(fù)蘇實驗操作手冊,僅供參考。
Cryostar?凍存試劑盒(貨號UH-F1002-050)的內(nèi)容如下:
2 Cryostar? 重懸液(Cryostar? Resuspension Medium),1瓶,液體,25ml。-20 °C長期保存,一旦開始使用,放置于4°C冰箱。
2 Cryostar? 2×凍存液(Cryostar? 2× Freezing Medium),1瓶,液體,25ml,-20 °C長期保存,一旦開始使用,放置于4°C冰箱。
2 英文原裝操作手冊一本;中文詳細(xì)操作手冊一本。
2. 細(xì)胞凍存、復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)程序
l 實驗儀器:
2 可控溫度細(xì)胞離心機離心機;
2 血球計數(shù)板或者自動細(xì)胞計數(shù)設(shè)備;
2 細(xì)胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”;
2 -70°C冰箱;
2 液氮罐;
2 37°C水浴鍋。
l 耗材準(zhǔn)備
2 15ml圓錐底聚丙烯(PP)離心管;
2 無菌的細(xì)胞凍存管,2ml,外螺旋;
l 試劑配制
2 熱失活補體胎牛血清;
2 R0培養(yǎng)基:RPMI-1640培養(yǎng)基,含谷氨酰胺,加入1%雙抗,不加血清。
2 達(dá)優(yōu)®無血清培養(yǎng)基:已經(jīng)含有谷氨酰胺和雙抗,打開即用。
2 Cryostar?重懸液(Cryostar? Resuspension Medium):含有細(xì)胞凍存保護(hù)成分,-20°C長期保存,4°C可以保存6個月。
2 Cryostar? 2×凍存液(Cryostar? Freezing Medium):含有細(xì)胞凍存保護(hù)成分以及DMSO,-20°C長期保存,4°C可以保存6個月。
2 臺盼藍(lán)
l 細(xì)胞凍存程序
1. 將備用細(xì)胞凍存管做上詳細(xì)記號。細(xì)胞凍存管、細(xì)胞凍存盒、Cryostar? 重懸液、Cryostar? 2×凍存液放入4 oC熱平衡。
2. 對要凍存細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),然后4 oC,400g離心10 min。
3. (冰上操作)棄上清,根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果加入4 oC的Cryostar? 重懸液重懸,使細(xì)胞濃度調(diào)整到兩倍的凍存濃度(比如想要凍存的細(xì)胞濃度為:1×107 cells/ml,就用重懸液將細(xì)胞濃度調(diào)整到2×107/ml),然后將細(xì)胞吹打均勻。
注意:重懸液不含有DMSO,所以這一步動作可以稍微劇烈。
4. (冰上操作)然后逐滴加入等體積冰浴的Cryostar? 2×凍存液,(細(xì)胞濃度變?yōu)?×107 cells/ml)。
注意:一定要逐滴加入,避免溶液中DMSO濃度的劇烈變化,詳見后面的說明。
5. (冰上操作)以每只1ml細(xì)胞懸液的量分裝入在-20oC熱平衡過的凍存管,然后將凍存管的蓋子擰嚴(yán)實。否則液氮會滲漏進(jìn)來。
6. 立即將凍存管放入已在4oC熱平衡的凍存盒(“Mr. Frosty”),然后將凍存盒放入-70oC冰箱內(nèi)。也可以將凍存管放于程序降溫儀中,以1oC/min的速率降溫到–70oC。
7. 24hr后,把-70oC保存的凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中。
8. 將細(xì)胞在液氮罐中凍存位置記錄在實驗室的液氮設(shè)備管理單上。
l 細(xì)胞復(fù)蘇程序
1.血清、R0培養(yǎng)基需要在4oC熱平衡,Lympho-Spot?無血清培養(yǎng)基需要37oC熱平衡。15ml離心管需要4oC熱平衡。水浴鍋要預(yù)先調(diào)到37oC。
2.用夾子將細(xì)胞凍存管從液氮中取出。如果有液氮滲漏到凍存管中,要稍微擰開管蓋,讓氣化的液氮逃逸。
警告:據(jù)報道,有些凍存管在解凍時會發(fā)生爆炸,為了消除這種危險,建議實驗中只使用牢固的聚乙烯凍存管用于液氮保存。
3.用夾子持住凍存管,浸入37oC水浴鍋內(nèi)。輕輕晃動凍存管,注意管內(nèi)凍存細(xì)胞的融化情況。當(dāng)管內(nèi)的冰核還有黃豆大小的時候,取出來,轉(zhuǎn)移到超凈工作臺內(nèi)。用酒精棉擦拭管口,然后將凍存管插于碎冰之上。
注意:這一步對細(xì)胞存活率至關(guān)重要。既要盡快融化,以減少融化過程對細(xì)胞的損害;又要盡可能減少細(xì)胞在較高溫度停留的時間,以減少DMSO對細(xì)胞的毒害。切不可將凍存管放在在燒杯內(nèi)不管。
4.(冰上操作)用移液槍取1ml胎牛血清(4oC),槍頭插到凍存管管底,緩慢地加入這一毫升血清。
5.(冰上操作)溫柔地將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液吸取出來,轉(zhuǎn)移到一個預(yù)冷的15ml離心管內(nèi)。然后,用移液槍取1mlR0培養(yǎng)基(4oC),槍頭插到離心管管底,緩慢地加入這一毫升培養(yǎng)基。然后換槍頭再重復(fù)兩次,一共向離心管管底加入3ml的R0培養(yǎng)基。
6. 蓋上離心管管蓋,輕輕上下顛倒混勻。然后緩慢的補加R0培養(yǎng)基到14ml,此時不再需要從管底加入了。補加滿,然后蓋上管蓋,輕輕的上下顛倒混勻。
7. 4oC,400g離心10min,棄上清,加入1ml Lympho-Spot?無血清培養(yǎng)基,混合均勻。
8.(優(yōu)化步驟,可以略過)如果細(xì)胞有成團現(xiàn)象,這是由于死亡細(xì)胞釋放出來的DNA纏繞所致??梢约尤?.1ml DNase(1mg/ml),37 oC孵育10min。
9. 取20μl細(xì)胞懸液,臺盼藍(lán)活細(xì)胞計數(shù),計算存活率(viability)。
根據(jù)計數(shù)結(jié)果,補加Lympho-Spot?無血清培養(yǎng)基至所需要的細(xì)胞濃度,進(jìn)行ELISPOT檢測。