抑制ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)*新方法

一、封閉液、洗滌液及保護(hù)液的優(yōu)化

1、封閉液的優(yōu)化

采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行封閉，其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。

2、 洗滌液的配制

采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法配制洗滌液。

3、 酶標(biāo)板保護(hù)液的優(yōu)化

酶標(biāo)板經(jīng)過封閉后在低溫下僅能存放2周左右，為了延長固相酶標(biāo)板上抗原的穩(wěn)定性，我們?cè)黾恿艘徊奖Ｗo(hù)酶標(biāo)板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無關(guān)蛋白質(zhì)、慶大霉素以及二價(jià)金屬離子，作為酶標(biāo)板保護(hù)劑，在封閉完后加入保護(hù)液于4℃冰箱中孵育過夜，同時(shí)與未做保護(hù)的酶標(biāo)板進(jìn)行對(duì)照，然后將保護(hù)的及未保護(hù)的酶標(biāo)板置于37烘箱中放置15天，考察保護(hù)液對(duì)酶標(biāo)板的穩(wěn)定性的影響。

二、酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化

抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標(biāo)抗體做系列稀釋：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇A值為1.5左右的酶標(biāo)抗體稀釋度為*適工作濃度。

三、酶標(biāo)抗體保護(hù)液的優(yōu)化

低濃度的酶標(biāo)抗體極容易受到高溫、微生物、以及蛋白酶的影響而失活，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的貨架期，過去通常將酶標(biāo)抗體凍干保存，然而這樣的保存，不僅由于在凍干的過程中會(huì)影響酶標(biāo)抗體的活性，而且在臨床應(yīng)用中頗為不便。適當(dāng)?shù)木彌_液以及添加無關(guān)蛋白質(zhì)、糖、防腐劑以及一些含氨基的化合物等都會(huì)對(duì)對(duì)酶標(biāo)抗體的活性起一定的保護(hù)作用，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了一組保護(hù)劑用于保護(hù)酶標(biāo)抗體，與未添加任何糖蛋白的酶標(biāo)抗體做對(duì)照，將經(jīng)保護(hù)的酶標(biāo)抗體及未保護(hù)的酶標(biāo)抗體置于37℃烘箱中放置6天，考察保護(hù)液對(duì)酶標(biāo)抗體的影響。一、 抗體的酶標(biāo)記及質(zhì)量鑒定

本試驗(yàn)采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶標(biāo)記在抗體上[1]，標(biāo)記完后取上清用Sephedex G200 凝膠層析進(jìn)行純化，洗脫液為0.2mol/L pH7.4的PBS，流速為15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度計(jì)測A280吸光度值，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做圖，ELISA試劑盒收集**峰即為酶標(biāo)抗體峰。標(biāo)記完后用紫外分光光度計(jì)在分別在280nm、及403nm處測定酶標(biāo)記物的A值，計(jì)算**球蛋白量、摩爾比值、酶結(jié)合率以及標(biāo)記率。

四、包被用緩沖液及*適包被抗原濃度的優(yōu)化

1、包被緩沖液的優(yōu)化

包被抗原時(shí)，為了得到*佳的包被效果，我們采用了碳酸鹽緩沖液（50mM ph9.6 ）、磷酸鹽緩沖液（50mM ph7.6）、以及TRIS鹽酸緩沖液（50 mM ph7.6）三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ug/ml，及2.5ug/ml,酶標(biāo)抗體工作濃度為1：400及1：300，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇*佳的包被緩沖液系統(tǒng)。同時(shí)為了保證緩沖液能夠長期保存，我們?cè)诎灰褐刑砑恿?.01%的硫柳汞作為防腐劑。

2、*適抗原包被濃度的優(yōu)化

用優(yōu)化好的包被緩沖液，將包被抗原（ALB）稀釋成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六個(gè)濃度，包被微孔板，每孔100ul；競爭抗原濃度為4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶標(biāo)抗體稀釋度為1：300，經(jīng)孵育、顯色、終止后用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析。顯色的強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與包被的抗原量成正比，但隨著包被抗原濃度的增加，顯色的強(qiáng)度反而降低，我們選擇臨界包被值作為包被抗原量。