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大鼠磷酸化AKT蛋白檢測試劑盒之后我又用單抗包被，結(jié)果一樣：陰性、空白值好高。
1.包被：將三種單抗混合，1：1000，1:2000,1:4000......1:128000稀釋，做三個(gè)平行，4°過夜。
2.**天洗滌4次，每次3min，拍干。5%脫脂乳封閉，37°，2h。
3.洗滌4次，每次3min，拍干。加抗原（為純化好的原核表達(dá)蛋白）稀釋濃度為2微克/ml，同時(shí)設(shè)陰性對照（胎牛血清1：100稀釋），大鼠磷酸化AKT蛋白檢測試劑盒空白對照（PBS溶液)。37°，1h。
4.洗滌4次，每次3min，拍干。加酶標(biāo)抗體（1:1000稀釋），37°，1h。
5.洗滌4次，每次3min，拍干。加TMB顯色，每孔100微升。37°，10min。
6.2M硫酸終止，
7.OD450讀數(shù)。
大鼠磷酸化AKT蛋白檢測試劑盒結(jié)果，陽性值2.5，陰性對照和空白值很高可達(dá)到1.5。之后我又用細(xì)胞上清包被，其他和上面一樣，加酶標(biāo)抗體（1:1000稀釋），封閉用的是1%明膠和2%的BSA，2%的BSA封閉：陰性值1.8，陽性和空白值都在2.0以上。1%明膠封閉：陰性值1.0，陽性和空白值都在2.0以上。
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